L'insegnamento intende introdurre gli studenti alle problematiche dei processi di produzione di proteine ricombinanti ad uso farmaceutico. Si darà particolare attenzione alla produzione di biofarmaci attualmente in commercio, a partire dalla selezione del vettore di espressione fino alle operazioni di separazione, purificazione e caratterizzazione del prodotto finito. Le lezioni di teoria saranno arricchite con la presentazione di alcuni casi di studio (ormoni polipeptidici, citochine, proteine del sangue, enzimi con proprietà terapeutiche, vaccini, anticorpi monoclonali) e dallo svolgimento di una esercitazione sperimentale volta all’estrazione di proteine da cellule e loro purificazione. Durante il corso, si prevedono visite ad alcune aziende del settore farmaceutico.

Al termine del corso, lo studente dovrà conoscere i processi di produzione (upstream e downstream) di alcuni prodotti biofarmaceutici (ad esempio, ormoni polipeptidici, citochine, proteine del sangue, enzimi con proprietà terapeutiche, vaccini, anticorpi monoclonali), i metodi di coltura di microrganismi e cellule animali, le principali tecniche di separazione e purificazione (cromatografia, elettroforesi, cristallizzazione), i processi di sanitizzazione e sterilizzazione di impianti farmaceutici, nonché la struttura ed organizzazione di un impianto di produzione di biofarmaci. Inoltre, lo studente dovrà conoscere le principali metodologie analitiche utili per definire il grado di purezza dei prodotti biofarmaceutici di cui sopra. Nello specifico, lo studente dovrà acquisire le seguenti competenze: (1) scelta del sistema di espressione idoneo alla produzione del biofarmaco; (2) definire uno schema di processo per la produzione delle principali classi di prodotti biofarmaceutici, definendo le unità operative e le apparecchiature più idonee; (3) eseguire calcoli di progetto per la scelta delle condizioni operative che soddisfino le specifiche di processo o prodotto desiderate. Al termine del corso, lo studente dovrà presentare i risultati di un lavoro di gruppo finalizzato alla definizione del processo di produzione di un biofarmaco assegnato.

Lo studente potrà proficuamente seguire l'insegnamento se conosce: • i meccanismi di trasporto di quantità di moto, energia e materia • conoscenza di base di microbiologia biochimica e biologia molecolare

PARTE I. Processi upstream Le biotecnologie farmaceutiche: principi e tecniche di produzione. La produzione di proteine da geni clonati in E.coli  Vettori specifici per l’espressione di geni eterologhi in E. coli  Problemi comuni nella produzione di proteine ricombinanti in E. coli La produzione di proteine ricombinanti nelle cellule eucariotiche  Lieviti (S, cerevisiae e P. pastoris) e funghi filamentosi (A. nidulans e T. reesei)  Cellule di mammifero,  Cellule di insetto Il “pharming”  La produzione di proteine ricombinanti in animali  La produzione di proteine ricombinanti in piante Metodi di coltura di microrganismi e cellule animali  Terreni per la coltura di microrganismi  Terreni per la coltura di cellule animali  Fattori che influenzano la scelta del tipo di coltura  Colture di laboratorio e su larga scala  Bioreattori per la coltura di microrganismi  Bioreattori per la coltura di cellule animali La produzione di principi farmaceutici con la tecnologia del DNA ricombinante  La produzione di insulina e ormoni della crescita in E.coli  La produzione di EPO in cellule animali  La produzione di anticorpi monoclonali  La produzione di vaccini L’ ingegneria proteica per il miglioramento delle caratteristiche farmacocinetiche di proteine ricombinanti.  Principali tecniche di mutagenesi in vitro  Proteine ricombinanti di seconda generazione Medicinali per terapie avanzate  La terapia cellulare  La terapia genica PARTE II. Processi downstream Il processo di produzione di un biofarmaco  Il sito produttivo o Camera bianca o Pulizia, decontaminazione e sanitizzazione dell’area di produzione e degli impianti o Acqua per la produzione di un biofarmaco: produzione di acqua ultra-pura e per preparati iniettabili  Il processo di produzione di un biofarmaco o Analisi di un caso di studio: la produzione di interferone-w o Processi di downstream: analisi della catena produttiva di un farmaco contenente un principio attivo proteico. Caso di studio tissue plasminogen activator (tPA) Il problema della formulazione di un biofarmaco  Meccanismi molecolari alla base della denaturazione proteica o Proteolisi o Deamidazione o Ossidazione e rottura di ponti disolfuro o Glicosilazione o Stress legati al processo di congelamento o di essiccamento o Interazioni con le interfacce solido-liquido  Eccipienti utilizzati nelle formulazioni biofarmaceutiche  Meccanismi di stabilizzazione proteica durante il congelamento, ecciccamento e all’interfacce solido-liquido Processi di purificazione di miscele proteiche  Separazione delle cellule dal mezzo di coltura (centrifugazione e filtrazione)  Separazione del prodotto proteico (lisi delle cellule per via chimica, biologica e meccanica)  Tecniche di concentrazione (evaporazione, lisciviazione, precipitazione e adsorbimento). Tecniche di analisi e purificazione di macromolecole biologiche  Cromatografia o Principi generali o Cromatografia in fase inversa o Cromatografia di interazione idrofobica o Cromatografia a scambio ionico o Cromatografia di esclusione dimensionale o Cromatografia di affinita` o Cromatografia elettrocinetica micellare  Elettroforesi o Elettroforesi su piastra o Elettroforesi capillare o Elettroforesi capillare zonale o Elettroforesi gel-capillare  Liofilizzazione o Formulazione di preparazioni iniettabili contenenti proteine o Tecniche di caratterizzazione della formulazione nativa e del prodotto finito: calorimetria differenziale, crio-microscopia, o Congelamento: principi generali, parametrici critici, scelta delle condizioni operative, tecniche innovative per il controllo della fase di congelamento o Essiccamento primario e secondario: principi generali, parametri critici, calcoli di progetto per la scelta delle condizioni operative o Analisi di immagine e tecniche di sperlatura o Impianti batch e continui: liofilizzazione in massa (spray freeze-drying) e di dosi singole  Sterilizzazione o Teoria del processo o Metodi fisici (calore umido e calore secco, radiazioni ionizzanti, filtrazione) o Metodi chimici (ossido di etilene) o Impianti di sterilizzazione e controllo dell’efficacia del processo o Tecniche di sterilizzazione di biofarmaci iniettabili Analisi del processo di produzione di alcuni biofarmaci o Insulina o Glucagone o hGH o tPA PARTE III. Esercitazione di gruppo Si prevedono due esercitazioni di gruppo: 1. Esercitazione progettuale: sulla base della letteratura scientifica, definire il processo di produzione di un biofarmaco assegnato. 2. Esercitazioni di laboratorio: (1) Rottura di cellule microbiche mediante sonicazione e/o omogeneizzatore di Potter; (2) separazione dei detriti cellulari con centrifugazione; (3) purificazione delle proteine con ultra- e diafiltrazione; (4) determinazione della concentrazione proteica mediante spettrometria UV-Vis (5) valutazione della purezza delle proteine mediante SDS-PAGE. Nota. Qualora non fosse possibile svolgere le attività del progetto sperimentale in presenza, si prevederanno delle videoleazioni in cui si mostrerà lo svolgimento delle varie attività sperimentali e si forniranno agli studenti i risultati di tali attività per una loro rielaborazione.

Le lezioni in aula sono alternate a esercitazioni di calcolo sugli argomenti affrontati a lezione. Nella seconda parte del corso è previsto che gli studenti si organizzino in gruppi e si occupino della definizione di un processo per la produzione di un biofarmaco assegnato. E’ inoltre previsto lo studio sperimentale di un processo di estrazione e purificazione di proteine da cellule microbiche . I risultati ottenuti nel corso delle esercitazioni dovranno essere presentati al docente nella forma di una relazione di gruppo scritta.

I seguenti testi sono consigliati per chiarimenti sugli argomenti trattati a lezione: • Calabrò M. L. 2012. Compendio di biotecnologie farmaceutiche. EdiSES. • Brown T. A. 2017. Biotecnologie molecolari. Zanichelli. • Najafpour G. D. 2007. Biochemical engineering and biotechnology. Elsevier. • Vegeto E., Maggi A., Minghetti P. Farmaci Biotecnologici 2020 CEA • Walsh G. 2003. Biopharmaceuticals: biochemistry and biotechnology. Wiley.

Modalità di esame: Prova orale obbligatoria; Elaborato progettuale in gruppo;

La verifica dell’apprendimento avviene mediante un esame orale che verterà su tutti gli argomenti del corso. La durata del colloquio è di circa 45 minuti. Per accedere all’esame orale occorre aver conseguito una valutazione positiva della relazione di gruppo relativa alla definizione di un processo di produzione e purificazione di un prodotto biofarmaceutico assegnato. La valutazione della relazione sarà pubblicata sul portale della didattica prima della sessione d’esame e il voto massimo ottenibile è pari a 3 punti. Nel caso in cui la valutazione della relazione fosse “non sufficiente”, lo studente avrà a disposizione 15 giorni dalla data di pubblicazione dei risultati per rivedere la relazione e, se le correzioni sono ritenute soddisfacenti, accedere alla prova orale. Il voto massimo ottenibile con l’esame orale è 27 punti a cui si aggiungono quelli della relazione di gruppo per un totale di massimo di 30 punti.

Modalità di esame: Prova orale obbligatoria; Elaborato progettuale in gruppo;

La verifica dell’apprendimento avviene mediante un esame orale che verterà su tutti gli argomenti del corso. La durata del colloquio è di circa 45 minuti. Nel caso in cui non fosse possibile svolgere il colloquio in presenza, lo si svolgerà da remoto. Per accedere all’esame orale occorre aver conseguito una valutazione positiva della relazione di gruppo relativa alla definizione di un processo di produzione e purificazione di un prodotto biofarmaceutico assegnato. La valutazione della relazione sarà pubblicata sul portale della didattica prima della sessione d’esame e il voto massimo ottenibile è pari a 3 punti. Nel caso in cui la valutazione della relazione fosse “non sufficiente”, lo studente avrà a disposizione 15 giorni dalla data di pubblicazione dei risultati per rivedere la relazione e, se le correzioni sono ritenute soddisfacenti, accedere alla prova orale.